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现代生物技术概论复习提纲

1 现代生物技术概论复习提纲

第六章 蛋白质工程

1. 了解蛋白质分子之间的相互作用;

蛋白质的亚基可以被解离成游离亚基,在一定条件下又可以重新聚合;某些具有四级结构的蛋白质分子之间,亚基可以聚合,产生有活性的杂交分子;不少多肽和蛋白质分子,不论其是否由亚基组成,都能聚合成聚合物。

2. 蛋白质工程的基本任务;

以蛋白质结构与功能为基础,通过化学和物理手段,对目标基因按预期设计进行修饰和改造,合成新的蛋白质;对现有的蛋白质加以定向改造、设计和构建,最终生产出比自然界存在的蛋白质更优良、更符合人类需求的功能蛋白质。

3. 图6-6蛋白质工程研究策略,利用反向生物学手段;

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蛋白质工程的主要研究手段:利用所谓的反向生物学技术,其基本思路是按期望的结构寻找最适合的氨基酸序列,通过计算机设计,进而模拟特定的氨基酸序列在细胞内或在体内环境中进行多肽折叠而成三维结构的全过程,并预测蛋白质的空间结构和表达出生物学功能的可能及其生物活性的高低程度。

4. 改变先有蛋白质结构的基本步骤;

①分离纯化目标蛋白质。

②分析目标蛋白质的一级结构;分析目标蛋白质的三维结构以及结构与功能的关系。

③根据蛋白质的一级结构设计引物,克隆目的基因。

④根据蛋白质的三维结构和结构与功能的关系以及蛋白质改造的目的设计改造方案。

⑤对目的基因进行人工定点突变。

⑥改造后的基因在宿主细胞中表达。

⑦分离纯化表达的蛋白质并分析其功能,评价是否达到设计目的。

5. 改变蛋白质结构的核心技术包括基因的人工定点突变和蛋白质的人为进化,具体内容;

(1)基因人工定点突变技术:

①M13载体法:该法的原理是利用人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物,利用M13噬菌体载体系统合成突变基因。

②PCR 扩增法:该法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物,通过PCR 扩增而获得定点突变的基因。PCR 定点诱变法可分为重组PCR 定点诱变法和大引物诱变法两种。

(2)蛋白质的人为进化

易错PCR 和DNA shuffling (DNA 改组)

单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随机大小的DNA 片段。无引物PCR ,具有互补3'末端的片段互为引物,各为模板,通过不断的PCR 循环在不同模板上随机互补结合并进一步延伸。最后利用基因两端序列为引物合成全长的重排产物,这些重排产物的集合被称为突变文库。对突变文库进行筛选,选择改良的突变体进行下一轮shuffling 循环,重复多次重排和筛选,直到最终获得性状比较理想的突变体。

6. 举两个蛋白质工程的应用实例;

(1)胰蛋白酶:223个氨基酸残基和以异亮氨酸为N 端的单肽链。Arg117位自溶点的缺失突变,得到缺失突变体,其结果表明该突变体的稳定性明显提高。将酶分子表面的正电荷改变成负电荷,以提高胰蛋白酶催化活性中心His57的pKa 值,在pH 较高的条件下显示出对精氨酸具有更高的专一性。

(2)金属硫蛋白:富含半胱氨酸的小分子蛋白,半胱氨酸巯基可以结合大量的金属元素;金属硫蛋白由

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